Verifikace thermocyclerů a optimalizace podmínek PCR na Ústavu lékařské genetiky FNOL

Abstract

Diplomová práce se zaměřuje na srovnávací analýzu thermocyclerů, což jsou zařízení používaná k amplifikaci vybraných úseků DNA, podle konkrétních vyšetření. Amplifikované úseky jsou následně analyzovány pomocí dalších technologií, jako je například kapilární elektroforéza, která umožňuje separaci a kvantifikaci vzniklých produktů. Výtěžnost polymerázové řetězové reakce (PCR) je ovlivněna kvalitou a množstvím vstupní DNA, správným poměrem reagencií a nastavením použitého systému. Klíčové je zajistit stabilitu teploty v bloku, kde jsou umístěny zkumavky s PCR reakcí, a rychle se přizpůsobit změnám teploty v opakujících se intervalech. Cílem práce je ověřit thermocycler podle interního předpisu, který vychází z normy ČSN EN ISO 15189 - ed.3, a optimalizovat podmínky PCR pomocí různých koncentrací vstupní DNA a různých rychlostí ohřevu během PCR podle nastaveného teplotního profilu v thermocycleru. Vše za použití certifikovaných kitů od výrobců, které slouží k vyšetření cystické fibrózy (CF), dihydropyrimidin dehydrogenázy (DPYD) a k určení klinické diagnózy Peutz-Jeghersova syndromu (PJS) pomocí SALSA MLPA Probemix P101 STK11. Stabilita teploty bude ověřena metodou Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA), kde je nutné udržet stabilní teplotu minimálně po dobu 16 hodin. Výsledné produkty budou analyzovány pomocí fragmentační analýzy s využitím kapilární elektroforézy.

The thesis focuses on a comparative analysis of thermocyclers, devices used for amplifying selected DNA segments, according to specific assays. The amplified segments are subsequently analyzed using additional technologies, such as capillary electrophoresis, enabling the separation and quantification of the resulting products. The yield of polymerase chain reaction (PCR) is influenced by the quality and quantity of input DNA, the correct ratio of reagents, and the settings of the used system. Ensuring temperature stability in the block where the PCR reaction tubes are placed and rapidly adapting to temperature changes at recurring intervals are crucial. The aim of the thesis is to verify the thermocycler according to an internal procedure, based on the ČSN EN ISO 15189 - ed.3 standard, and to optimize PCR conditions using various concentrations of input DNA and different heating rates during PCR according to the set temperature profile in the thermocycler. All using certified kits from manufacturers, intended for the examination of cystic fibrosis (CF), dihydropyrimidine dehydrogenase (DPYD), and for determining the clinical diagnosis of Peutz-Jeghers syndrome (PJS) using SALSA MLPA Probemix P101 STK11. Temperature stability will be verified using the Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) method, where it is necessary to maintain a stable temperature for at least 16 hours. The resulting products will be analyzed using fragment analysis with capillary electrophoresis.